该研究是继2017年《Dl-3-n-Butylphthalide Treatment Enhances Hemodynamics andAmeliorates Memory Deficits in Rats with Chronic Cerebral Hypoperfusion》（IF: 4.504）与2019年《Dl-3-n-Butylphthalide regulates theAng-1/Ang-2/Tie-2 signaling axis to promote neovascularization in chroniccerebral hypoperfusion》（IF: 3.457）的后续研究，该研究团队之前的丁苯研究表明，NBP可以迅速加速CBF的酞减通过恢复和认知功能的改善。

血管性痴呆（VD）被广泛认为是知障证据排名第二位的最常见的痴呆症类型。VD主要与多种脑血管疾病相关，碍新例如慢性脑低灌注（CCH）。／GFRα／CCH由脑血流量（CBF）的号通慢性、中度和持续性缺陷引起。丁苯实验室和临床研究有越来越多的酞减通过证据表明CCH是脑血管疾病和神经退行性疾病发病机制中的极其重要的共同因素，CCH会导致诸如VD的知障证据认知障碍症状的发生和发展。

但到目前为止，由CCH造成的复杂病理变化仍然很难被治愈。BCCAO动物模型通常应用于研究由低灌注引起的VD。血管假说表明，因为CBF减少和长时间缺氧所导致的中度和持续性脑灌注不足所引发的血管和神经毒性作用，会促进神经变性并导致认知障碍。神经元是脑的神经血管单元的组成部分，属于电功能细胞，需要持续的葡萄糖和氧供应。神经元死亡是CCH相关VD的关键标志，是神经元丢失的主要原因。海马体在学习，记忆巩固和信息检索的认知过程中起着关键作用。因此，海马神经元脆弱性和CCH诱导的认知损伤之间可能存在关联。恢复CBF和抢救濒死神经元是两种主要的治疗CCH相关VD的方法思路。但是由于临床低灌注发生的确切时间，以及再灌注后神经元损伤的不可逆性存在不确定性，因此，了解CCH中海马体的神经元死亡的分子机制对于开发新的用以缓解血管性认知障碍的医疗方法将更有价值。

该团队之前的研究表明，NBP可以迅速加速CBF的恢复和认知功能的改善。此外，在针对没有痴呆症状的皮质下血管性认知障碍的临床的治疗中发现，NBP可改善认知功能并具有良好的安全性。然而，在CCH诱导的认知障碍中尚未充分阐明NBP针对海马神经元细胞凋亡的潜在治疗靶点。

本研究有两个主要目的：第一，使用抗体微阵列鉴定CCH诱导的VD大鼠模型中的潜在生物靶点；其次，探索NBP在靶向潜在生物靶点中的保护作用。研究表明，胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF）/GDNF家族受体α-1（GFRα 1）/受体酪氨酸激酶（Ret）信号通路在CCH大鼠的海马体中会发生变化。而NBP能改善认知功能，通过调节GDNF/GFRα1/Ret信号通路保护海马神经元，阻止其凋亡，并激活磷酸化AKT（p-AKT）和ERK1/2（p-ERK1/2）信号通路。研究发现培养的海马神经元经过1小时氧-葡萄糖剥夺（OGD），然后再灌注（R）48小时会导致GDNF/GFRα1/Ret信号通路的下调，而NBP可上调信号传导并提高神经元的存活率。Ret抑制剂（NVP-AST487）能抑制Ret和下游效应物，包括p-AKT和p-ERK1/2。我们发现通过与NVP-AST487共孵育，特别是在OGD/R的条件下，海马神经元中的GDNF和GFRα1表达都被显著抑制。NBP可维持GDNF/GFRα1/Ret信号传导和神经元活力，并激活p-AKT和p-ERK1/2，增加Bcl-2的表达，并降低Bax和cleaved caspase-3的表达。

图1（A）体内实验流程图。

8周龄的成年雄性SD大鼠适应性喂养4周。在12周龄前一天（12w-1d），进行MRI扫描，在手术前（BCCAO前）测定CBF。在12周龄时，进行手术并使用MRI（手术后15分钟）检测CBF。大鼠被随机分为3组：假手术组（对照手术），双侧颈动脉按BCCAO组的方法分离，未结扎；CCH组（BCCAO手术），双侧颈动脉双重结扎；CCH + NBP组：BCCAO手术联合连续NBP注射3周。在BCCAO手术（20周龄）后8周，MWM测试中评估行为功能，并且使用MRI扫描检测CBF。处死大鼠进行进一步的实验（21周龄）（B）本实验中的动物分组。大鼠随机分为3组：假手术组（sham），未结扎；CCH组，双重结扎手术后8周，注射试剂；CCH + NBP组：在BCCAO手术后8周的前3周注射NBP。（C）通过MRI图像显示皮质和海马中CBF的变化。彩色图像来自3D ASL，灰色图像来自T2WI。红色和绿色圆圈分别表示检测到海马体和皮质中CBF的ROI。直方图显示BCCAO手术后不同组的定量结果。（D）与闭塞前的CBF相比，BCCAO手术后15分钟和BCCAO后8周的双侧皮质和海马体中的CBF下降（P <0.01）。与BCCAO组相比，NBP组的CBF增加。（* P <0.05，** P <0.01，与BCCAO前比较；#P <0.05，## P <0.01，NBP组与CCH组比较）。（E）MWM图。四种颜色将圆形游泳池（大圆圈）划分为四个象限（黄色，第一象限；红色，第二象限；绿色，第三象限；蓝色，第四象限）。空方块表示第二象限中的平台。（F）从第1天到第5天不同组的逃避潜伏期时间变化（* P <0.05，** P <0.01，CCH组与假手术组比较；##P <0.01，CCH + NBP组与假手术组比较；&P <0.05，&& P <0.01，CCH与CCH + NBP组比较）。（G）第6天大鼠的游泳路径。CCH组中平台象限中的游泳路径距离减少。NBP增加了大鼠在平台上的频率。（H）3组大鼠在平台上的频率的量变比较（* P<0.05，CCH组与假手术组比较；#P <0.05，CCH与CCH + NBP组比较）。CCH：CCH 8w；CCH + NBP：CCH 8w + NBP。

图2  DL-3-N-正丁基苯酞改善海马体的病理变化。

（A）3组大鼠海马体HE染色显微照片。HE染色可观察大鼠海马体的形态学变化。在CCH组的CA1和CA3区域的SP中检测到神经元损伤。与CCH组相比，NBP组显著增加了存活神经元的数量。（B）3组大鼠海马体Nissl染色显微照片。在CA1和CA3区域以及CCH组中DG区域的GL的部分区域中检测到神经元损伤。正常的神经元排列整齐，形态正常，核和核仁明显；异常的神经元形态发生改变，萎缩并出现深染。NBP保护神经元防止其凋亡并减少了对海马形态结构的损害。CCH：CCH 8w；CCH + NBP：CCH 8w + NBP。CA，海马体；DG，齿状回区；SO，海马体起层；SP，锥体细胞层；SR，辐射层；ML，分子层；GL，颗粒细胞层；PL，多态层。CA1区域，放大倍数200×，比例尺= 50μm，CA3和DG区域，放大倍数100×，比例尺= 100μm

图3 DL-3-N-正丁基苯酞改善了CCH模型中海马神经细胞的凋亡。

TUNEL染色（绿色）显示了在BCCAO后8周的假手术组，CCH组和CCH + NBP组的海马体（CA1（A），CA3（B）和DG（C）区域）中的神经元凋亡情况。细胞核用DAPI（蓝色）染色。CA1区域，放大倍数400×，比例尺= 25μm。CA3和DG区域，放大倍数200×，比例尺= 50μm。（D）体内HIF-1α和cleaved caspase-3表达情况的Western blotting分析。（E）定量HIF-1α和cleaved caspase-3的表达直方图。β-actin作为内参。n = 3次独立重复实验。（* P <0.05，CCH组与假手术组比较；#P <0.05，CCH组与CCH + NBP组比较）（F）Bcl-2家族蛋白参与NBP的抗细胞凋亡作用。（G）Bcl-2，Bax和Bcl-2 / Bax比率的定量表达直方图。β-actin作为内参。n = 3次独立重复实验。（** P<0.01，CCH组与假手术组比较；## P<0.01，CCH组与CCH + NBP组比较。）（H）NBP可预防海马神经元的形态和超微结构的变化。假手术组：皮层神经元显示大圆核，双核膜清晰完整。CCH组：神经元形态不规则，可观察到染色质浓缩，细胞质溶解和空泡形成，核膜和神经元的细胞器溶解或消失。NBP组：显示神经元损伤减轻（n = 5只大鼠数/组）。比例尺= 2μm。CCH：CCH 8w; CCH + NBP：CCH 8w + NBP

图4  DL-3-N-正丁基苯酞激活GDNF /GFRα1/ Ret和下游p-AKT / p-ERK1 / 2信号通路，在OGD / R模型中保护海马神经元防止其凋亡。

（A）免疫荧光显示OGD / R显著减少神经元GDNF+阳性的表达，而NBP增加神经元GDNF+阳性的表达。放大倍数400×，比例尺= 25μm。定量分析面积为200 μm2。（B）免疫荧光显示OGD / R显著降低神经元GFRα1+阳性的表达，而NBP增加神经元GFRα1+阳性的表达。放大倍数400×，比例尺= 25μm。定量分析面积为200 μm2。（C）免疫荧光显示OGD / R显著降低神经元Ret+阳性的表达，而NBP增加神经元Ret+阳性的表达。Ret抑制剂也降低了神经元Ret+阳性的表达，而NBP增加了神经元Ret+阳性的表达。放大倍数400×，比例尺= 25μm。定量分析面积为200 μm2。（D）神经元GDNF+阳性表达的定量分析直方图。（n = 3个副孔/每组。** P <0.01，OGD / R与对照相组比较；## P <0.01，OGD / R + NBP组与OGD / R组比较。）（E）神经元GFRα1+阳性表达的定量分析直方图。（n = 3个副孔/每组。** P <0.01，OGD / R与对照相组比较；## P <0.01，OGD / R + NBP与OGD / R比较。）（F）神经元Ret+阳性表达的定量分析直方图。（n = 3个副孔/每组。** P <0.01，与对照组比较；## P<0.01，OGD / R + NBP与OGD / R比较；＆P <0.05，OGD / R + Ret i 与OGD / R比较；＃’P <0.05，OGD / R + Ret i +NBP与OGD / R + Ret i比较。Ret i：Ret抑制剂。）（G）Western blotting显示OGD / R显著降低GDNF / GFRα1 / Ret / p-AKT / p-ERK1 / 2的表达，而NBP显著增加GDNF / GFRα1 / Ret / p-AKT / p-ERK1 / 2的表达。当Ret的表达被抑制时，GDNF /GFRα1和p-AKT / p-ERK1 / 2也显著降低，但是，NBP显著增加了GDNF /GFRα1和p-AKT / p-ERK1 / 2的表达。（H）GDNF的相对强度的定量分析直方图。（I）GFRα1的相对强度的定量分析直方图。（J）Ret的相对强度的定量分析直方图。（K）t-AKT的相对强度的定量分析直方图。（L）p-AKT（Ser473）的相对强度的定量分析直方图。（M）t-ERK1（pT202 / pY204）的相对强度的定量分析直方图。（N）p-ERK1（pT202 / pY204）的相对强度的定量分析直方图。（○）t-ERK2（pT185 / pY187）的相对强度的定量分析直方图。（P）p-ERK2（pT185 / pY187）的相对强度的定量分析直方图。（n = 3个副孔/每组。* P <0.05，** P <0.01，相对于对照；#P <0.05，## P<0.01，OGD / R + NBP组与OGD / R组比较；＆P <0.05，OGD / R + Ret i 组与OGD / R组比较；＃’P<0.05，## ’P <0.01，OGD / R + Ret i + NBP组与OGD / R + Ret i组比较。OGD / R:OGD 1h/ R 48h，Ret i:Ret抑制剂）

图5 NBP触发海马神经元中抗凋亡信号通路摘要图 

NBP调节CCH中GDNF / GFRα1 / Ret信号通路，激活下游p-AKT（Ser473）和p-ERK1（pT202 / pY204）/ ERK2（pT185 / pY187）信号通路，上调Bcl-2的表达，下调Bax和cleaved caspase-3的表达，最终阻断细胞凋亡。

通过一系列的研究探索，我们发现GDNF/GFRα1/Ret信号通路在CCH诱导的VD中起重要作用，NBP通过对GDNF/GFRα1/Ret和AKT/ERK1/2信号通路的调节实现对海马神经元细胞凋亡的保护作用，从而减少认知障碍。

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